如何開展蛋白質N-糖基化修飾功能研究

蛋白質N-糖基化修飾及其研究的意義

蛋白質 N-糖基化修飾在生物體中非常重要，蛋白質N-糖基化修飾影響蛋白質折疊、穩定性、細胞定位、受體-配體相互作用等。它的研究也一直是蛋白質組學、細胞生物學與疾病機制研究的熱點。N-糖基化研究能解釋“為什么同一個蛋白在不同情況下功能不同"： 同一種蛋白，即使氨基酸序列相同，N-糖基化位點的占據率與糖型組成仍會隨細胞狀態變化而變化。蛋白質N-糖基化修飾對疾病機制與生物標志物開發尤為關鍵：N-糖基化與多種疾病密切相關：

? 癌癥：腫瘤常伴隨糖基化加工失衡，出現糖型重塑，影響腫瘤生長、侵襲、免疫逃逸。

? 免疫疾病：糖型改變會影響免疫細胞受體功能與免疫識別。

? 遺傳與罕見病：糖基化通路酶或轉運相關基因異常會導致廣泛的蛋白錯誤折疊與功能缺陷。

? 感染與炎癥：病原體與宿主之間的糖識別、炎癥信號都可能涉及 N-糖基化變化。

如何進行蛋白質N-糖基化修飾研究

蛋白質 N-糖基化（N-glycosylation） 的研究通常要覆蓋：位點鑒定→ 糖型（結構）分析 → 蛋白表達（折疊/表達/定位/穩定性等）→ 功能或通路驗證。目前常用的驗證策略如下

1) 設計突變

對目標位點的 Asn進行突變，做至少三組：WT（野生型）、單突變（每個位點各自）、多位點突變/組合突變（如果多個位點貢獻疊加）。

2) N-糖基化對蛋白質表達的影響

n 表達量（Western/ELISA/流式）

n 蛋白穩定性（Cycloheximide追蹤或蛋白半衰期）

n 亞細胞定位（免疫熒光/流式表面染色/分級提取）

n 整體折疊狀態（必要時做構象抗體或SEC/DSF）

3) 根據你的蛋白功能選擇合適功能實驗，例如：

n 酶活（底物底物法）

n 受體/配體結合（SPR/BLI/共沉淀）

n 信號通路激活（報告基因 ）

n 運輸/分泌（分泌量、細胞表面水平）

n 細胞表型（增殖、遷移、凋亡等；最好回到分子層面）

4) 抑制糖基化或者類型

n 抑制糖鏈合成/轉移：使 N-糖基化整體減少或改變

n 抑制特定糖基化酶：例如巖藻糖轉移酶等

n 抑制加工（ER→Golgi）：改變糖型成熟度

案例分享——PD-1

1. PD-1是高度糖基化修飾的蛋白質

PD-1（Programmed cell death-1，程序性死亡受體1）是腫瘤免疫治療中最核心的免疫檢查點之一。PD-1是一種表達在免疫細胞表面的抑制性免疫檢查點受體。它的主要作用是幫助機體在免疫反應過強時“剎車"，維持免疫穩態；但在腫瘤中，PD-1 通路會被利用來讓腫瘤逃避免疫清除。研究發現，PD-1 在 N49、N58、N74 和 N116 位置發生 N-連接糖基化，這一過程由糖基轉移酶 B3GNT2 促進。此外，PD-1 的核心巖藻糖糖基化發生在 N49 和 N74 位點，由核心巖藻糖糖基轉移酶 FUT8 介導。此外，PD-1 在 T153、S157、S159 和 T168 位點發生 O-連接糖基化。

圖1 PD-1 的糖基化和巖藻糖化調控的示意圖

2. N-糖基化修飾對PD-1的影響研究案例

盡管使用單克隆抗體進行PD-1 阻斷治療在臨床上取得了成功，但大多數患者對這種治療沒有反應，而PD-1 的潛在調節機制仍未wan全明確。

作者通過突變、功能實驗等，表明 PD-1在T細胞中廣泛進行N-糖基化，并且其特定糖型的強度在TCR 激活后會發生變化；糖基化對于維持 PD-1 蛋白的穩定性和細胞表面定位至關重要；PD-1的糖基化，尤其是 N58 位點的糖基化，對于介導其與 PD-L1的相互作用是bi不可少的。

此外作者基于目前PD-1靶向治療的局限性，設計單克隆抗體 STM418 特異性靶向糖基化的PD-1，其與PD-1 的結合親和力高于已獲批的PD-1抗體，能有效抑制PD-L1/PD-1結合，并增強抗腫瘤免疫反應。這些研究結果共同揭示了PD-1葡糖基化的功能意義，并為將葡糖基化的PD-1作為免疫治療潛在策略加以靶向提供了理論依據。文章整體設計及結果如下所示：

圖2 文章設計及結果總結